Thai Journal of Botany:Gene cloning and recombinant protein production of NAD kinase1 from rice (Oryza sativa L.): การโคลนยีนและการสร้างโปรตีนรีคอมบิแนนต์ NAD kinase1 จากข้าว (Oryza sativa L.)

Article's details
	Share
Title:	Gene cloning and recombinant protein production of NAD kinase1 from rice (Oryza sativa L.)
ชื่อบทความ:	การโคลนยีนและการสร้างโปรตีนรีคอมบิแนนต์ NAD kinase1 จากข้าว (Oryza sativa L.)
Author:	THUNCHANOK DUMRISUK, KANOKTIP PACKDIBAMRUNG & TEERAPONG BUABOOCHA
ชื่อผู้แต่ง :	ธันย์ชนก ดำริห์สุข กนกทิพย์ ภักดีบำรุง และ ธีรพงษ์ บัวบูชา
Pages:	173 - 180
Year:	2553
Year No.:	2
Volume:	พิเศษ Show All Articles
Abstract:	เอ็นเอดีไคเนส (NAD kinase) เป็นเอนไซม์ที่พบทั้งในเซลล์โปรคาริโอตและยูคาริโอตทำหน้าที่สร้าง NADP+ จาก NAD+ โดยใช้พลังงานจาก ATP ผ่านปฏิกิริยาฟอสฟอรีเลชัน NAD+ และ NADP+ เป็นตัวรับอิเล็กตรอนที่สำคัญในระบบเมแทบอลิซึม ควบคุมปฏิกิริยารีดอกซ์ในเซลล์ และ ป้องกันเซลล์จาก reactive oxygen species (ROS) งานวิจัยนี้เป็นการศึกษายีน NAD kinase1(NADK1) จากจีโนมข้าว (Oryza sativa L.) โดยการโคลนยีน NADK1 เข้าสู่ pET21a(+) และส่งถ่ายพลาสมิดรีคอมบิแนนต์เข้าสู่ Escherichia coli สายพันธุ์ Rosetta จากการตรวจสอบการสร้างโปรตีนโดยวิธี SDS-PAGE และ Western blot analysis พบว่าโคลนรีคอมบิแนนต์สามารถสร้างโปรตีนรีคอมบิแนนต์ NADK1 ขนาดประมาณ 60 kDa ได้ปริมาณมากในส่วน inclusion bodies เมื่อนำโปรตีนมาละลายด้วยยูเรียความเข้มข้น 8 โมลาร์ แล้ว refold พบว่าโปรตีนไม่มีแอกติวิตีของ NAD kinase แต่สามารถติดตามแอกติวิตีของ NAD kinase ได้ในส่วน soluble protein โดยการทำ In-gel activity staining ของเจลชนิด Native-PAGE และเมื่อวัดแอกติวิตีด้วยปฏิกิริยารีดักชันของ dichlorophenol indophenol (DCIP) พบว่ามีค่าเท่ากับ 1.39 μmol NADP/min/mg การทำ soluble enzyme ให้บริสุทธิ์โดยนิกเกิลคอลัมน์ ได้เอนไซม์ที่มีแอกติวิตีจำเพาะเท่ากับ 31.33 μmol NADP/min/mg และมีความบริสุทธิ์เพิ่มขึ้น 23 เท่า NAD kinase is found in both prokaryotic cells and eukaryotic cells. It catalyzes the phosphorylation of NAD+ to NADP+ using ATP. NAD+ and NADP+ act as important electron acceptors in numerous metabolic pathways. They maintain redox homeostasis and prevent cells from reactive oxygen species (ROS). In this study, NAD kinase 1 (NADK 1) from the rice(Oryza sativa L.) genome was cloned into the expression vector pET21a(+) and the resulting recombinant plasmid was introduced into Escherichia coli strain Rosetta. As a result, a large amount of recombinant protein with an estimated size of 60 kDa was detected in the inclusion bodies by SDS-PAGE and western blot analysis. The insoluble protein was then solubilized with 8 M urea, refolded and purified by Ni-column chromatography but no NAD kinase activity could be found. However, NAD kinase activity was detected in the soluble protein fraction by in-gel activity staining of native-PAGE and was determined to be 1.39 μmol NADP/min/mg when measured in reactions involved dichlorophenol indophenol (DCIP) reduction. The soluble enzyme was then purified by Ni-column chromatography and its NAD kinase specific activity was 31.33 μmol NADP/min/mg with 23 purification fold.

download count: